紫外分光光度計(jì)的工作原理主要基于朗伯-比爾定律(Lambert-Beer Law)。
當(dāng)一束紫外或可見光通過含有吸光物質(zhì)的均勻溶液時,部分光會被溶液中的吸光物質(zhì)所吸收,導(dǎo)致光強(qiáng)度減弱。
吸光物質(zhì)對光的吸收程度與溶液中吸光物質(zhì)的濃度、光通過溶液的路徑長度(通常稱為光程)以及吸光物質(zhì)對特定波長光的吸收系數(shù)有關(guān)。
具體來說,入射光強(qiáng)度(I?)與透過光強(qiáng)度(I)之間的關(guān)系可以用朗伯-比爾定律表示為:A = -log (I / I?) = ε × c × l ,其中 A 為吸光度,ε 為摩爾吸光系數(shù)(與物質(zhì)的性質(zhì)及入射光波長有關(guān)),c 為溶液中吸光物質(zhì)的濃度,l 為光程。
在紫外分光光度計(jì)中,光源發(fā)出連續(xù)的紫外-可見光,經(jīng)過單色器分光,得到特定波長的單色光,然后照射到裝有樣品溶液的比色皿中。檢測器測量透過樣品溶液后的光強(qiáng)度,并與入射光強(qiáng)度進(jìn)行比較,從而計(jì)算出吸光度。
通過改變?nèi)肷涔獾牟ㄩL,并測量不同波長下的吸光度,就可以得到物質(zhì)的吸收光譜。根據(jù)吸收光譜的特征峰位置和強(qiáng)度,可以對物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。
例如,在測定蛋白質(zhì)濃度時,由于蛋白質(zhì)中的芳香族氨基酸在 280nm 波長處有特定的吸收,通過測量該波長下的吸光度,結(jié)合已知的摩爾吸光系數(shù)和光程,就可以計(jì)算出蛋白質(zhì)的濃度。